神經(jīng)細胞培養(yǎng)基質總結
2011-04-12
[1888]
培養(yǎng)細胞的*培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基（如MEM）和添加劑（如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長因子）組成，培養(yǎng)基的配方一直在改進，其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。
基礎培養(yǎng)基
絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液（BSS）基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質。zui廣泛應用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規(guī)含有無機鹽和代謝添加劑（例如核苷酸）。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，形成神經(jīng)生物學zui通用的培養(yǎng)基。Dulbecco`s改良培養(yǎng)基――DMEM，現(xiàn)應用于快速生長的細胞，同MEM含有相同的營養(yǎng)成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養(yǎng)基，應仔細了解成分表，應知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。例如，有些培養(yǎng)基在氨基酸中包括有谷氨酸，而這種培養(yǎng)基雖廣泛用于神經(jīng)生物學領域，但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言，則并非*選擇，特別是如果神經(jīng)元生長在缺乏膠質的環(huán)境中時。 F12中含有硫酸亞鐵，據(jù)報道也有神經(jīng)毒效應。
在所有這些培養(yǎng)基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因為它具有不穩(wěn)定性以及在許多細胞培養(yǎng)中它常用作碳源。對于神經(jīng)元的培養(yǎng)常常在基礎培養(yǎng)基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培養(yǎng)基中這兩種物質缺乏時）。MEM與F12均要用5% 的CO2來平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來平衡，當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養(yǎng)基的組成成分是建立在對不同細胞系生長的研究之上的，但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結果。
原則上，HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。實際操作中并非如此簡單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細胞生長，該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎，它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。這一培養(yǎng)基的優(yōu)點是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時，例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養(yǎng)基已用來成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元，但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測過。
血清
細胞在單純的基礎培養(yǎng)基中不能存活，在特殊類型的細胞培養(yǎng)中必須提供某些痕量營養(yǎng)物質及生長因子才能使細胞得以生長并維持生長狀態(tài)?；A培養(yǎng)基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經(jīng)驗確定，廣泛應用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細胞用的血清，也用于細胞系和原代培養(yǎng)。而馬血清常常用來作有絲分裂后的神經(jīng)元培養(yǎng)。然而，很多人也將胎牛血清用于神經(jīng)元培養(yǎng)，也有人用馬血清來培養(yǎng)膠質細胞。用大鼠進行神經(jīng)元培養(yǎng)的某些研究者喜歡使用同型血清；人類的胎盤血清，亦曾用于神經(jīng)組織的器官類型的培養(yǎng)，也用在一些特殊培養(yǎng)種類中。
血清的不同批號含有不同的成分，所以許多人發(fā)現(xiàn)，應該在使用前對血清進行測試。大多數(shù)試劑商提供樣品，所滿意的批號即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。
無血清培養(yǎng)基
1979年神經(jīng)細胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個重要進展，用化學添加劑即可維持神經(jīng)細胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養(yǎng)物和促貼壁的物質的組合置換培養(yǎng)基中的成分，zui后找到了適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)，zui早是用在B104大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系的培養(yǎng)。它的基礎培養(yǎng)基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數(shù)類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。
未料到的是上述配方構成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實驗室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中，細胞直接進入無血清培養(yǎng)，這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細胞的增殖，故可使神經(jīng)元純化。
血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當缺乏這些成分時，如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養(yǎng)細胞的存活。有學者發(fā)現(xiàn)細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時變小，特別是神經(jīng)元與膠質共培養(yǎng)時，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質如谷氨酸。
應該注意，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學限定性的，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動，培養(yǎng)起始時可能有些物質缺乏，而后細胞的產(chǎn)物可能積累，從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實是有另一方面的好處，即條件培養(yǎng)基（已培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基）的形成，條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質細胞的發(fā)育。
生長因子絕大多數(shù)哺乳類胚胎神經(jīng)元有嚴格的營養(yǎng)要求，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分，將會使絕大多數(shù)神經(jīng)元在體外培養(yǎng)的數(shù)天中死亡。解決這一問題有兩條思路，一是讓培養(yǎng)細胞提供自己的營養(yǎng)因子，二是在培養(yǎng)基中加入純的生長因子。如果細胞混合物能在高密度時生長，所需的生長因子便會積累到可觀的數(shù)值，尤其當培養(yǎng)基很少變化時。若某種細胞混合物生長時有很少的營養(yǎng)需求，可保持培養(yǎng)基在一段時間里不作任何變動，以使營養(yǎng)（生長）因子積累，而zui后促使所需要的細胞類型能夠生長。但是，這種對營養(yǎng)（生長）因子自身倚賴性亦有弊端，因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖，某些細胞會因生長條件的貧乏而受限制。另外，這種方法只能進行相當高密度的細胞培養(yǎng)。因為培養(yǎng)基的條件在細胞的較低密度時變的不夠有效。不過某些時候純化神經(jīng)元群體的低密度培養(yǎng)可用條件培養(yǎng)基（經(jīng)過了高密度培養(yǎng)）進行，或在膠質上生長的神經(jīng)元所用過的培養(yǎng)基來支持。滿足神經(jīng)元營養(yǎng)需求的第二條途徑是向培養(yǎng)基中加入生長因子。通常用于組培的通用適宜因子是神經(jīng)生長因子NGF。不過，只有少數(shù)對這種蛋白質有反應的細胞類型的細胞才能生長。
許多PNS類型的神經(jīng)元在離體狀態(tài)時表現(xiàn)出簡單的營養(yǎng)需求，只需提供單一的營養(yǎng)因子就足以使其在低密度時增殖。例如，大鼠交感神經(jīng)元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經(jīng)元可在嚴格局限條件下生長好幾個月（即在無血清培養(yǎng)基中、或缺乏膠質細胞、或在化學限定基質上）。有證據(jù)表明NGF是活體中交感神經(jīng)元存活的生理調節(jié)因子。然而，交感神經(jīng)元也對來自膠質細胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）有反應，還有NT3、LIF與CNTF也對其有作用。在不產(chǎn)生 GDNF或NT3的動物中，交感神經(jīng)元會有損傷。在離體與活體營養(yǎng)需求之間的差別或許可以用在不同環(huán)境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養(yǎng)中的NGF彌散在整個環(huán)境中，而在活體內，大部分區(qū)域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數(shù)實驗中已經(jīng)習慣了營養(yǎng)因子的zui大效應使用量，其他營養(yǎng)因子的協(xié)同效應在亞優(yōu)劑量下更容易觀察到。此外，高濃度的營養(yǎng)因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應的，低濃度的營養(yǎng)因子可能用來檢查表現(xiàn)型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應。有許多其他的PNS培養(yǎng)系統(tǒng)只需單一營養(yǎng)因子就可使有實用價值的細胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元。不過，這些模型也有局限性。例如，培養(yǎng)中的睫狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元加入CNTF時，超過90%的神經(jīng)元能存活一個很長時期，但并未有跡象表明它屬于內源的靶細胞來源的營養(yǎng)因子，而是有爭論的相關分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經(jīng)節(jié)含有好幾種細胞群體，其中小細胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應，但其他神經(jīng)元，例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子有反應。因此，在大多條件下培養(yǎng)物的生長并不能忠實反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細胞培養(yǎng)中特別突出，因為已有的經(jīng)驗表明，沒有一種培養(yǎng)基能適合于所有類型及亞類的神經(jīng)細胞的生長。
現(xiàn)有的證據(jù)已表明，CNS神經(jīng)元的營養(yǎng)需求比PNS的更復雜。對脊髓運動神經(jīng)元與視網(wǎng)膜節(jié)細胞神經(jīng)元的研究表明，這些神經(jīng)元與外周神經(jīng)元相比能對更為廣泛的營養(yǎng)因子起反應。例如，至少發(fā)現(xiàn)了15種不同的分子可在離體條件下增加神經(jīng)元的存活。而且，已觀察到運動神經(jīng)元與視網(wǎng)膜對任何單獨的營養(yǎng)因子的存活反應，與PNS中所觀察到的典型反應相比，都要小得多。因此，大多數(shù)影響運動神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節(jié)細胞的營養(yǎng)因子僅僅只能支持神經(jīng)元的亞群，而神經(jīng)元的*存活要求諸多因子的結合。在視網(wǎng)膜節(jié)細胞的培養(yǎng)中，因子的*組合（如BDNF、CNTF、IGF、bFGF）包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結果的普遍性尚待進一步的證實，但敲除單一的營養(yǎng)因子基因之后，沒有表現(xiàn)出對CNS大多類群的神經(jīng)元的存活產(chǎn)生太大影響，這一觀察與上述的事實是一致的?，F(xiàn)已知少突膠質細胞的長期存活也需要眾多營養(yǎng)因子的相互作用。
抗生素
在細胞培養(yǎng)中zui常用的抗生素是青霉素（常用濃度是25~100ui/ml）與鏈霉素（25~100μg/ml）。這兩種抗生素?；旌鲜褂?。在一些實驗室里，它們常規(guī)加入所有的培養(yǎng)基中。慶大霉素（10~100μg/ml）通常有廣譜抗菌效應，并具有溶液穩(wěn)定性，故也被一些實驗室使用，特別是當有低水平的污染存在時更是這樣。以上這些試劑對霉菌與酵母菌的污染均無效。
盡管很多實驗室在細胞系的培養(yǎng)基中常規(guī)加入抗生素作繼代培養(yǎng)，但仍建議不要在原代培養(yǎng)中加入抗生素，其理由之一是獲得的細胞是無菌的，原代培養(yǎng)時的細菌污染很少發(fā)生。其次，盡管認為抗生素對細胞代謝的影響可忽略，但避免使用它們，以免細胞生長環(huán)境的不穩(wěn)定。zui重要的是要意識到培養(yǎng)中主要污染物的類型，它們通常暗示了問題的來源。
抗有絲分裂劑
某些DNA合成抑制劑對分裂細胞有毒，但對沒有DNA合成的細胞僅有輕微影響。由于神經(jīng)元通常缺乏DNA合成能力，因此對抗有絲分裂劑沒有多大反應。這樣的試劑常常用于神經(jīng)元的培養(yǎng)，以消除或減少非神經(jīng)元群體。若要殺死所有的非神經(jīng)元細胞，可以先加入血清或生長因子來保證有高比例的非神經(jīng)元細胞進行DNA合成，此時再加入抗有絲分裂劑。但是，某些細胞在它的細胞周期的某些時相時對抗有絲分裂劑是不敏感的。不過，可以重復的將抗有絲分裂劑使用于增殖的細胞群體。在CNS神經(jīng)元的培養(yǎng)中抗有絲分裂劑常常在星形細胞形成單層后加入，此時，星形細胞由于接觸抑制而終止了DNA的合成（即細胞停止增殖），它們不會因抗有絲分裂劑的加入而死亡。原代培養(yǎng)中用這種方法阻止成纖維細胞的過度增殖是十分必要的。有兩種抗有絲分裂劑常用于神經(jīng)元的培養(yǎng)： Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制劑，一般使用濃度為～10μM。尿苷（10μM）也常使用，可阻止不分裂細胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用濃度為5～50μM。使用任何一種抗有絲分裂劑，都必須考慮它的神經(jīng)原毒性，應該確定zui低效應的使用濃度。阿糖胞苷在很低的濃度下，也會對某些種類的神經(jīng)元有毒性，可以造成特定神經(jīng)原的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現(xiàn)出這種毒性。
培養(yǎng)的保持
培養(yǎng)物是應該保持在孵箱中的。孵箱可以自動將O2與CO2混合很快達到培養(yǎng)基的設計要求，空氣中的氧濃度比血液和腦脊液中要高得多。對于某些細胞的生長，包括神經(jīng), 元，應使氧含量處在一個較低的水平?？梢杂梅跸溥_到這個標準，但這樣的孵箱并未廣泛使用。
高濕度可避免培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的蒸發(fā)，保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水，這水應該經(jīng)常換，乘水容器應經(jīng)常消毒以防霉菌生長。若孵箱曾被霉菌孢子嚴重污染過，那么要想*去除污染則會非常困難。當培養(yǎng)物必須要長期保持在孵箱中時，應采用較少培養(yǎng)基的瓶、皿，且將蓋子蓋緊以避免蒸發(fā)，或采用相應的按比例供空氣的孵箱。
溫度的調節(jié)應定期檢查，孵箱溫度常設置為37℃或較低溫度。細胞在低溫時可有較長時間的忍耐限度，但當溫度升至39℃時，幾小時內即死亡。
維持培養(yǎng)物的*方案常常改變。例如培養(yǎng)膠質細胞時，要經(jīng)常換液以使其增殖達到zui大。而在培養(yǎng)某些神經(jīng)元時，則要求盡可能少的換液，神經(jīng)元在兩次換液之間的條件下長的。大腦皮質的培養(yǎng)要求在不換液的情形下維持一個月以上。另一方面，象海馬神經(jīng)元那樣的細胞，依賴于條件培養(yǎng)基，若換液太頻繁細胞就會衰退，此時，可采用1/3或1/2換液的方式
